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線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒(微量法)說明書
點擊次數(shù):1865 更新時間:2019-02-26

貨號:YJ1172                                      規(guī)格:100管/96樣

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取 2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶,也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化,并終把電子傳遞給氧,生成水。

測定原理:

還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收,線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;

試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存;

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g,4℃離心 5min。

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心 10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ(此步可選做)。

5、步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測定。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

(1)工作液的配制:臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置于37℃(哺

乳動物)或 25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑 4℃可保存一周;

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和200μL工作液,混勻,立即記錄550nm

處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,計算 ΔA=A1-A2。

注意點: 若 ΔA 大于0.2,需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)(計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),

使 A1-A2 小于 0.2,可提高檢測靈敏度。

復(fù)合體Ⅳ活力單位的計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d )×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=222×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.444×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.1×10 -4 L;ε:細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),1.91×104 L/ mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

b.使用 96 孔板測定的計算公式如下:

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=2198×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重 )=[ΔA×V反總÷(ε×d )×109]÷(W×V樣 ÷V樣總)÷T=444×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.888×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.1×10 -4 L;ε:細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),1.91×104 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

 

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